Wyprowadzanie zarodkowych komórek macierzystych z ludzkich blastocyst

Embrionalne komórki macierzyste mają wyjątkową zdolność do tworzenia wszystkich typów komórek dorosłych. Wykorzystanie tego potencjału może dostarczyć źródła komórek, które zastąpią utracone lub upośledzone w wyniku choroby. Co więcej, pozyskiwanie ludzkich zarodkowych komórek macierzystych otwiera wyjątkowe okno do badania wczesnego rozwoju człowieka. Obecnie około 15 ludzkich linii embrionalnych komórek macierzystych jest publicznie dostępnych i różnią się one znacznie pod względem przydatności do badań i zakresu ich charakterystyki (patrz: http://stemcells.nih.gov/registry/index.asp). Aby promować dalsze badania z wykorzystaniem ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, staraliśmy się uzyskać pełniejsze i bardziej charakterystyczne linie komórkowe spełniające surowe kryteria łatwości manipulacji, w tym pasażowanie enzymatyczne za pomocą trypsyny, usprawnione procedury zamrażania i rozmrażania, dobrze zdefiniowane pożywki hodowlane i proste metody do różnicowania in vitro. Zgłaszamy pochodzenie i charakterystykę 17 dodatkowych ludzkich embrionalnych linii komórek macierzystych. Ryc. 1. Ryc. 1. Wyprowadzanie i różnicowanie ludzkich zarodkowych komórek macierzystych. Panel A pokazuje ludzki zarodek na stadium blastocysty, Panel B pokazuje początkowy wzrost wewnętrznej masy komórek po immunochirurgii, a Panel C pokazuje kolonie ludzkich zarodkowych komórek macierzystych po dysocjacji enzymatycznej. Wykazano fluorescencyjne wybarwienie fluorescencyjne linii komórkowej HUES6 (czerwone) z przeciwciałami anty-Tuj1 (panel D, x 25), przeciwciałami przeciw MF20 (panel E, x 25) i przeciwciałami przeciw fcoprzeciwciał a (panel F, x 25). . Wykazano immunobarwienie potworniaka wynikającego z linii komórkowej HUES2 (czerwone) z przeciwciałami anty-Tuj1 (panel G, x 25), przeciwciałami przeciw MF20 (panel H, x 40) i przeciwciałami anty-alfa-fetoproteiny (panel I, × 40). W panelach D, E, F, G, H i I, jądra są wybarwione na niebiesko za pomocą dichlorowodorku 4 , 6-diamidyno-2-fenylidolu.
Uzyskaliśmy zamrożone embriony ludzkie w stadium odszczepiania i stadium blastocysty, wyprodukowane przez zapłodnienie in vitro do celów klinicznych, po uzyskaniu pisemnej zgody i zgody od uczelnianej komisji naukowej Harvardu. Łącznie 286 zamrożonych i rozmrożonych rozszczepionych zarodków (po 6 do 12 komórek) hodowano do stadium blastocysty, a 58 zamrożonych i rozmrożonych blastocyst pozostawiono do ponownego rozprężenia w hodowli, po czym potraktowano roztworem Tyrode a w celu usunięcia zona pellucida , a następnie immunochirurgia mająca na celu izolację mas komórek wewnętrznych.1 Wiele z tych zarodków było tak słabej jakości, że nie rozwinęły się ani nie rozdzieliły po rozmrożeniu. Niemniej jednak wyodrębniono 97 wewnętrznych mas komórek i 17 indywidualnych ludzkich embrionalnych linii komórek macierzystych (HUES1 do HUES17) uzyskano zgodnie z opublikowanymi protokołami, które zmodyfikowaliśmy pod względem składu pożywki, enzymatycznej dysocjacji oraz procedur zamrażania i rozmrażania (Figura 1A). , Ryc. 1B i Ryc. 1C) .2-4 Zbyt mało embrionów było dostępnych dla nas, aby systematycznie określać, czy zmiany proceduralne, które wykorzystaliśmy, w znacznym stopniu przyczyniły się do sukcesu, który osiągnęliśmy. Szczegółowy podręcznik naszych metod hodowli blastocyst i izolowania embrionalnych komórek macierzystych dostępny jest w innym miejscu.5
Do wyprowadzenia użyto blastocyst reprezentujących szeroki zakres morfologicznych gatunków (patrz Tabela w Uzupełniającym Dodatku 1, dostępne wraz z pełnym tekstem tego artykułu na stronie www.nejm.org) .6 Chociaż embriony z stadium rozszczepienia, które były bardzo złej jakości często nie rozwinęły się do stadium blastocysty, linie komórkowe wytworzono z trzech blastocyst, które w innym przypadku zostałyby odrzucone z powodu ich słabej charakterystyki morfologicznej
[przypisy: klimakterium, Mimośród, busulfan ]
[hasła pokrewne: przepiśnik allegro, nefropatia toczniowa, trojglicerydy norma ]