Reakcje (całkowita objętość 25 .l) zawierały 2,5 .l buforu 10X PCR Gold, 2,5 mM chlorku magnezu, 0,4 mM trifosforanów deoksynukleozydu (Roche Diagnostics), 0,8 mM każdego z dwóch starterów i 0,5 jednostki polimerazy DNA AmpliTaq Gold. (Applied Biosystems). Próbki od pacjentów 1, 2, 3 i 4 testowano za pomocą zestawu primerów dla genu H5 (starter przedni H5-1: GCCATTCCACAACATACACCC; primer odwrotny H5-2: TAAATTCTCTATCCTCCTTTCCAA) o oczekiwanym rozmiarze produktu 358 pz, 2 i zestaw starterów dla genu N1 (starter przedni N1-1: TTGCTTGGTCAGCAAGTGCA, starter odwrotny N1-2: TCTGTCCATCCATTAGGATCC) o spodziewanym rozmiarze produktu 615 bp.7. Cykliczne cykle dla tych reakcji przeprowadzono w następujących warunkach: 94 ° C dla 3 minuty; 40 cykli w 94 ° C przez 30 sekund, 45 ° C (w przypadku H5) lub 55 ° C (w przypadku N1) przez 30 sekund i 72 ° C przez minutę; następnie 72 ° C przez 7 minut.
Próbki od pacjentów 5, 6, 7, 8, 9 i 10 testowano przy użyciu dwóch różnych zestawów starterów, które są swoiste dla genu H5 podtypu grypy A: para starterów H5-1 i H5-2 (jak opisano powyżej) i startera parą H5b (przedni primer H5 / 515: CATACCCAACAATAAAGAGG i starter odwrotny H5 / 1220: GTGTTCATTTTGTTAATGAT, z oczekiwanym rozmiarem produktu 708 bp). W przypadku próbek od tych sześciu pacjentów, gen N1 grypy amplifikowano za pomocą opisanych powyżej primerów, z tym wyjątkiem, że w primerach N1-1 była modyfikacja: TTGCTTGGTCAGCAAGTGCT. Wszyscy pacjenci zostali przebadani pod kątem podtypu H1 grypy A (z przednim starterem H1: AGCAAAAGCAGGGGAAAATAA i starterem odwrotnym H1: GCTATTTCTGGGGTGAATCT, spodziewanym rozmiarem produktu PCR, 729 bp) i podtypem H3 grypy A (z przednim starterem H3 : AGCAAAAGCAGGGGATAATTC i odwrotny primer H3: TGCCTGAAACCGTACCAACC, oczekiwany rozmiar produktu, 1143 bp).
Cykle termiczne dla wszystkich amplifikacji, z wyjątkiem fragmentu genu N1 grypy A, wynosiły 95 ° C przez 10 minut (wstępne rozgrzewanie wstępne); 10 cykli w 95 ° C przez 30 sekund, 55 ° C przez 30 sekund (zmniejszone o ° C na cykl) i 72 ° C przez minutę; i 40 cykli w 95 ° C przez 30 sekund, 45 ° C przez 30 sekund i 72 ° C przez minutę. W przypadku fragmentu genu N1 warunki cyklu termicznego wynosiły 95 ° C przez 10 minut; 10 cykli w 95 ° C przez 30 sekund, 60 ° C przez 30 sekund (zmniejszone o ° C na cykl) i 72 ° C przez minutę; i 40 cykli w 95 ° C przez 30 sekund, 55 ° C przez 30 sekund i 72 ° C przez minutę.
Produkty analizowano na 2% żelu agarozowym. Podjęto ścisłe środki ostrożności w celu uniknięcia zanieczyszczenia krzyżowego. Wszystkie próbki zostały uzyskane i przetransportowane w pojedynczych zamkniętych workach. Przygotowanie mieszanin RT-PCR, ekstrakcji kwasów nukleinowych oraz amplifikacji i analizy produktów PCR przeprowadzono w trzech oddzielnych laboratoriach. Odporne na działanie aerozolu końcówki filtrów (ART, Molecular BioProducts) były stosowane we wszystkich procedurach laboratoryjnych. Kontrole negatywne włączono podczas ekstrakcji RNA, odwrotnej transkrypcji i amplifikacji PCR.
Wyniki
Pacjenci i historia kontaktów
Rysunek 1. Rysunek 1. Mapa Wietnamu pokazująca zgłoszone przypadki ptasiej grypy A (H5N1). Średni wiek pacjentów (z których cztery to kobiety i sześciu mężczyzn) wynosił 13,7 lat (zakres od 5 do 24); żaden nie miał żadnych znanych, klinicznie znaczących wcześniej istniejących schorzeń
[hasła pokrewne: noni, wdrożenia magento, hurtownia portfeli ]
[patrz też: rak rdzeniasty, guz pancoasta objawy, pierwotna obustronna gonartroza ]
